技術(shù)文章
Technical articles小鼠肺血管內(nèi)皮細(xì)胞(PECs)是肺部血管的關(guān)鍵組成部分,對肺循環(huán)的穩(wěn)定和氣體交換功能具有重要作用。研究肺血管內(nèi)皮細(xì)胞有助于了解肺部疾病的機(jī)制,如肺動(dòng)脈高壓、肺水腫及其它血管相關(guān)疾病。本文簡要介紹了小鼠肺血管內(nèi)皮細(xì)胞的分離與培養(yǎng)方法。
一、材料與設(shè)備
1.動(dòng)物模型:健康C57BL/6小鼠(8-12周齡,雄性或雌性均可)
2.細(xì)胞培養(yǎng)基:EndothelialCellMedium(ECM),或含有10%胎牛血清(FBS)、1%抗生素(青霉素/鏈霉素)的DMEM/F-12混合培養(yǎng)基
3.試劑與工:胰蛋白酶、磷酸鹽緩沖液(PBS)、含膠原酶和DNA酶的消化液、離心管、培養(yǎng)皿、無菌操作臺(tái)
二、小鼠肺血管內(nèi)皮細(xì)胞的分離步驟
1.動(dòng)物麻醉與處死:使用異氟烷麻醉小鼠,通過頸部脫臼處死。之后迅速將小鼠胸腔暴露,并剪開胸腔,暴露出雙側(cè)肺臟。
2.肺臟灌注:在肺動(dòng)脈處插入針頭,通過心臟將1×PBS緩沖液注入肺臟,進(jìn)行灌注清洗,去除肺臟表面的血液。此步驟有助于減少血液中的紅細(xì)胞對細(xì)胞分離的干擾。
3.肺組織消化:將灌注清洗后的肺組織剪碎,放入含有膠原酶(1mg/mL)和DNA酶(20U/mL)的消化液中,37℃下消化30-45分鐘。消化過程中輕輕吹打以促進(jìn)組織分解。
4.細(xì)胞過濾與收集:消化后,將細(xì)胞懸液通過70μm細(xì)胞過濾網(wǎng)過濾,去除未完全消化的組織塊。收集濾液,加入PBS進(jìn)行多次離心洗滌(500×g,5分鐘),去除消化液和雜質(zhì)。
5.細(xì)胞培養(yǎng):將分離得到的細(xì)胞重新懸浮在培養(yǎng)基中,并接種于培養(yǎng)皿(T25或更大培養(yǎng)瓶)。使用含10%FBS的ECM培養(yǎng)基,置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
三、小鼠肺血管內(nèi)皮細(xì)胞的鑒定
1.形態(tài)觀察:在培養(yǎng)初期,血管內(nèi)皮細(xì)胞呈典型的多角形或長梭形,生長為單層鋪展的細(xì)胞。
2.免疫熒光染色:使用血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性標(biāo)志物進(jìn)行鑒定,如抗-CD31、抗-VE-cadherin、抗-vWF抗體。通過免疫熒光染色和顯微鏡觀察,驗(yàn)證細(xì)胞為內(nèi)皮細(xì)胞。
3.功能鑒定:細(xì)胞形成的血管樣結(jié)構(gòu)、白細(xì)胞黏附、流動(dòng)性測試等也可作為功能鑒定方法。
四、培養(yǎng)注意事項(xiàng)
1.培養(yǎng)環(huán)境:維持細(xì)胞在37℃、5%CO?環(huán)境下生長。定期更換培養(yǎng)基,通常每2-3天一次,確保細(xì)胞的營養(yǎng)供給。
2.細(xì)胞傳代:當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80%-90%時(shí),可用0.25%胰蛋白酶處理進(jìn)行傳代。傳代時(shí)應(yīng)盡量避免過度操作,保持細(xì)胞的良好狀態(tài)。
3.污染控制:在整個(gè)操作過程中,嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作,防止細(xì)菌、真菌等污染,影響細(xì)胞的生長與實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
小鼠肺血管內(nèi)皮細(xì)胞的分離與培養(yǎng)技術(shù)是研究肺血管生理及病理的基礎(chǔ)方法。通過適當(dāng)?shù)墓嘧ⅰ⑾图?xì)胞分離手段,可以獲得純度較高的肺血管內(nèi)皮細(xì)胞,為相關(guān)疾病模型的建立及藥物篩選提供了重要的實(shí)驗(yàn)平臺(tái)。在實(shí)際應(yīng)用中,細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境和操作細(xì)節(jié)對實(shí)驗(yàn)結(jié)果至關(guān)重要,需謹(jǐn)慎操作與優(yōu)化。